Гепатит с цитокины

Гепатит с цитокины

Переезд склада в Европу.
Реализуем препараты от гепатита С в России по закупочной цене - ликвидация склада
Перейти на сайт

Interleukin-1 and Tumor Necrosis Factor-α Trigger Restriction of Hepatitis B Virus Infection via a Cytidine Deaminase Activation-induced Cytidine Deaminase (AID)*
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3814766/

Справочная информация. Цитокины и факторы хозяина, вызывающие врожденный иммунитет против вируса гепатита B (HBV), недостаточно изучены.

Результаты: IL-1 и TNFα индуцировали Cytidine deaminase AID, фактор-хозяин против HBV и уменьшали инфекцию HBV в гепатоциты.

Вывод: IL-1 / TNFα снижает восприимчивость хозяина к инфекции HBV с помощью регуляции AID.

Значение: Провоспалительные цитокины модулируют инфекцию HBV через новый врожденный иммунный путь, включающий AID.

Вирусная инфекция ограничена внутриклеточными иммунными ответами в клетках-хозяевах, и это, как правило, модулируется стимуляцией цитокинов. Цитокины и факторы хозяина, которые определяют ограничение клеток-хозяев против заражения вирусом гепатита В (HBV), недостаточно изучены. Мы проверили 36 цитокинов и хемокинов, чтобы определить, какие из них способны снизить восприимчивость клеток HepaRG к инфекции HBV. Здесь мы обнаружили, что предварительная обработка IL-1β и TNFα значительно снижает восприимчивость клеток-хозяев к инфекции HBV. Этот эффект опосредовался активацией сигнального пути NF-κB. Цитидиндезаминаза, индуцированная активацией цитидиндезаминаза (AID), была активирована как IL-1β, так и TNFα в различных линиях клеток гепатоцитов и первичных человеческих гепатоцитах. Другие дезаминазы APOBEC3G не вызывались этими провоспалительными цитокинами. Нокдаун AID-экспрессии нарушал анти-HBV-эффект IL-1β и сверхэкспрессию антагонизированной HBV-инфекции, индуцированной AID, что указывает на то, что AID является одним из ответственных факторов анти-HBV-активности IL-1 / TNFα. Хотя AID индуцировала гипермутацию ДНК HBV, эта активность была непригодна для анти-HBV-активности. Противовирусное действие IL-1 / TNFα также наблюдалось на разных генотипах HBV, но не на вирусе гепатита C. Эти результаты показывают, что провоспалительные цитокины IL-1 / TNFα вызывают новый противовирусный механизм, включающий AID для регулирования дозволенности клеток-хозяев к инфекции HBV.

Внутриклеточный иммунный ответ может устранить патогены от хозяина, а клетки-хозяева обладают различными механизмами противодействия вирусной инфекции в зависимости от типа вируса. Инфекция вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) ограничена клеточными белками, обозначенными как факторы рестрикции, включая APOBEC3G (A3G), 3 TRIM5α, тетерин / BST-2 и SAMHD1 (1, 2). Все эти факторы могут быть вызваны стимуляцией интерфероном (IFN). Вирус гепатита С (HCV) исключается из ИФН I и III типов, полученных из дендритных клеток или инфицированных гепатоцитов (3-6). В гепатоцитах этот процесс включает ряд противовирусных факторов, которые являются нижестоящими генами IFN, IFN-стимулированных генов (ISG). Распространение вируса гриппа и вирулентность ингибируются цитокинами, такими как IFN и TNFα. Реактивные гены для этих механизмов включают индуцированные IFN клеточные Mx-белки, которые представляют собой динамин-подобные GTPases (7, 8). Однако эти антивирусные иммунные ответы, индуцированные цитокинами, плохо изучены при заражении вирусом гепатита В (HBV).

Инфекция HBV — это всемирная проблема здоровья, затрагивающая более 350 миллионов человек, и является основной причиной развития цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы (9-11). Во время инфекции количество цитокинов и хемокинов повышается у пациентов с HBV-инфицированным, включая IFNα / γ / λ, TNFα, IL-1, IL-6, IL-10, IL-12, IL-15 , и IL-8 (12-15). Сообщается, что некоторые из этих цитокинов подавляют репликацию HBV (3, 16-21). В частности, IFN типа I, II и III подавляют репликацию HBV in vitro и in vivo (19, 20, 22-26). Хотя один из нижестоящих генов IFN, A3G, имеет потенциал для уменьшения репликации HBV (27-34), все еще обсуждается, отвечает ли этот белок за анти-HBV-активность IFN типа I, поскольку он был ранее сообщается Trono и сотрудниками (28, 35), что индукция A3G не объясняет индуцированное IFN ингибирование репликации HBV. Более того, эти исследования проводились с использованием трансгена HBV, который воспроизводит только часть всего жизненного цикла HBV, в основном фокусируя внимание на внутриклеточной репликации HBV.

Здесь мы скринировали на цитокины и хемокины, которые влияли на инфицирование HBV в клетках HepaRG, клеточной линии гепатоцитов человека, восприимчивой к инфекции HBV и воспроизводящей весь жизненный цикл HBV (36, 37). IL-1 и TNFα уменьшали способность к клеткам-хозяевам инфицирования HBV, и этот эффект по меньшей мере частично опосредовался индукцией индуцированной активацией цитидинадезаминазы (AID). Активность анти-HBV IL-1 / TNFα была механически отличной от активности IFNα. Данное исследование представляет активность IL-1 / TNFα для подавления инфекции HBV в гепатоцитах независимо от влияния на иммунные клетки и физиологической роли AID в этом аппарате. Более того, насколько нам известно, это первый отчет, показывающий функцию AID для ингибирования инфицирования патогенного вируса человека.

Все цитокины были приобретены у PeproTech или R & D Systems. Гепарин получали из Mochida Pharmaceutical. Ламивудин, PD98059, SP600125, SB203580 и Bay11-7082 получали из Sigma. Энтекавир был получен из Santa Cruz Biotechnology. BMS-345541 и 6-амино-4- (4-феноксифенилэтиламино) хиназолин (QNZ) были приобретены у Merck.

Клетки HepaRG (Biopredic) культивировали с помощью среды Уильямса E (Invitrogen), дополненной 2 мм
1-глутамин, 200 единиц / мл пенициллина, 200 мкг / мл стрептомицина, 10% FBS, 5 мкг / мл инсулина (Wako), 20 нг / мл EGF (PeproTech), гидрокортизон 50 мкМ (Sigma) и 2% ДМСО ( Сигма). HepG2, HepAD38 (любезно предоставленный доктором Сигером в Центре рака Fox Chase) (38) и клетками HepG2.2.15 (добрый подарок от доктора Урбана в Гейдельбергском университете) (39) культивировали с использованием DMEM / F-12 + GlutaMAX (Invitrogen) с добавлением 10 мм HEPES (Invitrogen), 200 единиц / мл пенициллина, 200 мкг / мл стрептомицина, 10% FBS, 50 мкг гидрокортизона и 5 мкг / мл инсулина в присутствии (HepAD38 и HepG2.2.15) или отсутствия (HepG2) 400 мкг / мл G418 (Nacalai Tesque). Клетки HepAD38 культивировали с 0,3 мкг / мл тетрациклина при прекращении индукции HBV. Ячейки Huh-7.5.1 (любезно предоставленные доктором Чизари в Научно-исследовательском институте Скриппса) культивировали, как описано ранее (40). Первичные гепатоциты человека (PHH), выделенные из трансгеназных / SCID-мышей урокиназного типа, трансгенных / SCID-мышей, инокулированных PHH (PhoenixBio) или купленных из Lonza, культивировали с DMEM, дополненным 20 мм HEPES, 100 единиц / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 10 % FBS и 44 мм NaHCO3 или пируват 1 мм, несущественные аминокислоты, 20 мм HEPES, 200 единиц / мл пенициллина, 200 мкг / мл стрептомицина, 10% FBS, 0,25 мкг / мл инсулина (Вако), 5 нг / мл EGF и 50 нм дексаметазона.

HBV, используемый в этом исследовании, в основном был получен из клеток HepAD38, который классифицирован как генотип D (38). Средства из клеток HepAD38 в дни 7-31 после индукции HBV путем истощения тетрациклина восстанавливались каждые 3 дня. Среды очищали через 0,45 мкм фильтр и осаждали 10% PEG8000 и 2,3% NaCl. Осадки промывали и ресуспендировали со средой при ~ 200-кратной концентрации. ДНК HBV определяли количественно с помощью ПЦР в реальном времени. HBV-генотип A и C на фиг.7B выделяли из среды клеток HepG2, трансфицированных плазмидой pHBV / Aeus и pHBV / C-AT (41).

Клетки HepaRG были инфицированы HBV в 2000 году (рис.7B) или 6000 (другие цифры) эквивалент генома / клетка в присутствии 4% PEG8000 в течение 16 часов, как описано ранее (36). Городские и коллеги (42) сообщили, что для эффективной инфекции в клетки HepaRG требуется более 103 GEq / количество клеток HBV, полученных из клеток HepAD38 или HepG2.2.15 (т.е. 1,25-40 × 104 GEq / cell) в качестве инокулята. Эффект анти-HBV IL-1 / TNFα, показанный в этом исследовании, также наблюдался при инокуляции HBV при 300 GEq / cell (данные не показаны).

ДНК HBV экстрагировали из клеток или из среды с использованием набора ДНК (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя. Общая РНК была восстановлена ​​с помощью набора RNeasy mini (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя.

ДНК HBV определяли количественно с помощью ПЦР-анализа в реальном времени с использованием набора праймеров 5′-ACTCACCAACCTCCTGTCCT-3 ‘и 5′-GACAAACGGGCAACATACCT-3′ и зонда 5’-карбоксифлуоресцеина (FAM) -TATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGT-карбокситетраметилрадиамина (TAMRA) -3 ‘(43) , ПЦР проводили при 50 ° С в течение 2 мин, 94 ° С в течение 10 мин и 50 циклов 94 ° С в течение 15 с и 60 ° С в течение 1 мин. Обнаружение cccDNA было достигнуто с использованием 5’-CGTCTGTGCCTTCTCATCTGC-3 ‘и 5′-GCACAGCTTGGAGGCTTGAA-3′ в качестве праймеров и 5’-CTGTAGGCATAAATTGGT (MGB) -3 ‘в качестве зонда (44). Этот набор праймеров-зондов теоретически не обнаружил ни релаксированную кольцевую ДНК, ни ДНК HBV, интегрированную в геном-хозяином, но может захватывать cccDNA, как описано ранее (44). Для количественной оценки клеточной мРНК кДНК синтезировали из экстрагированной РНК с использованием SuperScriptIII (Invitrogen) с последующей ПЦР с помощью TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) и набора для праймера-зонда (анализ экспрессии гена TaqMan, Applied Biosystems) или с силовым SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) и 5’-AAATGTCCGCTGGGCTAAGG-3 ‘и 5′-GGAGGAAGAGCAATTCCACGT-3’ в качестве праймеров для AID.

RT-ПЦР выполняли, как описано ранее (45), используя одностадийный набор РНК ПЦР (Takara). Праймеры для амплификации каждого гена были следующими: 5′-CTCTGAGGTTTAGCATTTCA-3 ‘и 5′-CTCCAGGTCCAAAATGAATA-3′ для cIAP; 5’-GCAGATTTATCAACGGCTTT-3 ‘и 5′-CAGTTTTCCACCACAACAAA-3′ для XIAP; 5’-TAGCCAACATGTCCTCACAGAC-3 ‘и 5′-TCTTCTACCACTGGTTTCATGC-3′ для ISG56; 5’-GCCTTTTCATCCAAATGGAATTC-3 ‘и 5′-GAAATCTGTTCTGGGCTCATG-3′ для PKR; и 5’-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3 ‘и 5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3’ для GAPDH, соответственно.

Белок HBs количественно определяли с помощью ELISA, используя планшеты, инкубированные при 4 ° С в течение ночи с антителом против овуляции против HBs при разведении 1: 5000 (Maxisorp nunc-immuno plate, Nunc catalog no 439454) с последующим покрытием 0,2% BSA, 0,02% NaN3 , 1 × PBS при 4 ° C до использования. Образцы инкубировали с планшетами в течение 2 ч и четыре раза промывали TBST, в течение 2 ч добавляли меченое пероксидазой кроликов антитело против HBs. Раствор субстрата (набор ELISA для ядра HCV: Ortho) подвергали взаимодействию в течение 30 мин до измерения значений A450.

Косвенный иммунофлюоресцентный анализ выполняли, как описано ранее (45). После фиксации 4% параформальдегидом и пермеабилизацией с 0,3% Triton X-100 в качестве первичного антитела использовали антитело против HBc (DAKO, каталог B0586).

Анализ МТТ проводили, как описано ранее (46).

Анализ иммуноблота выполнялся, как описано ранее (47). Поликлональное антитело против AID было сгенерировано с использованием пептида, полученного из белка AID, в качестве иммуногена, как описано ранее для получения анти-AID-антитела 1 (48). Специфичность антитела описана ранее (48, 49).

Лентивирус, несущий shRNAs, был получен с 293T клетками, трансфецированными экспрессионными плазмидами для HIV-1 Gag-Pol, VSV G и shRNAs (sh-control, sh-cyclophilin A, sh-AID (1), sh-AID (2); shRNA) (Sigma) с Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Восстановленный лентивирусный вектор трансдуцировали в клетки HepaRG с последующим селекцией с 1,5 мкг / мл пуромицина. Лентивирусный сверхэкспрессирующий AID, AID-мутант, A3G или контрольный лентивирус был выделен с использованием экспрессионных плазмид для HIV-1 Gag-Pol, Rev, VSV G и соответствующего вектора экспрессии, как описано ранее (50).

Саузерн-блот выполняли, как описано ранее (41). После переваривания свободных нуклеиновых кислот ДНКазой I и РНКазой А клеточные лизаты расщепляли протеиназой K, а ДНК HBV в ядрах ядра экстрагировали фенолом / хлороформом с последующим осаждением изопропилового спирта. Зонд был приготовлен путем срезания pHBV / D-IND60 (41) с помощью SacII и BspHI для генерации полноразмерного ДНК-зонда HBV и помеченного реагентами прямой маркировки AlkPhos (GE Healthcare). Маркированные полосы визуализировали с помощью реагента обнаружения CDP-звезды (GE Healthcare).

После переваривания свободных нуклеиновых кислот ДНКазой I и РНКазой А нуклеокапсид осаждали PEG8000 (41). Затем суммарную РНК извлекали из ресуспендированных осадков. РНК HBV определяли количественно RT-PCR в реальном времени с 5′-TCCCTCGCCTCGCAGACG-3 ‘и 5′-GTTTCCCACCTTATGAGTC-3’ в качестве праймеров с помощью Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems).

Анализ ко-иммунопреципитации проводили, как описано (45).

Дифференциальную ДНК-денатурацию ПЦР выполняли, как описано ранее (51).

Трансфекцию ДНК проводили с pNF-κB-luc или pISRE-TA-luc (Stratagene) и pRL-TK (Promega), которые экспрессировали люциферазу светлячков, приводимую NF-κB или ISRE и люмиферазой Рениллы с помощью промотора тимидинкиназы герпеса-симплекс-вируса, соответственно , и Полиэтиленимин Макс (Polysciences Inc., каталог № 24765). После обработки соединения или цитокинов клетки лизировали и активность люциферазы измеряли, как описано ранее (52). Репортер, несущий промотор ядра HBV, был сконструирован путем вставки фрагмента ДНК (1413-1788 нуклеотидного числа) ДНК HBV (D-IND60) в вектор pGL4.28 (Promega) (41). В репортерном анализе, использующем эту конструкцию (фиг.1H), HX531, антагонист ретиноидного X-рецептора использовали в качестве положительного контроля, поскольку ретиноидный X-рецептор участвовал в транскрипции из основного промотора (53).

Чтобы оценить влияние цитокинов и хемокинов на восприимчивость к инфекции HBV, мы обработали клетки HepaRG (36) цитокинами в течение 3 ч до и 16 ч во время инфекции HBV, а затем культуру без стимулов в течение дополнительных 12 дней (фиг.1A, нижняя схема). Гепарин, конкурентный ингибитор прикрепления HBV (54), использовался как положительный контроль и уменьшал секрецию поверхностного белка вирусной оболочки (HBs) из инфицированных HBV клеток (фиг.1A, верхний график, дорожка 38), что предполагает успешной инфекции HBV в этом эксперименте. Изучение 36 цитокинов и хемокинов показало, что IL-1β резко уменьшает выделение белка из HBs (фиг.1A, верхний график, дорожка 8). Хотя IFN имели сильный анти-HBV-эффект при непрерывном лечении после инфицирования HBV (фиг.3C, панель b и данные не показаны), они имели лишь ограниченный эффект в этом скрининге, где цитокины были только предварительно обработаны и были связаны с HBV (фиг. 1A, дорожки 2-7). Экспрессия белка HBc (фиг.1B) и ДНК HBV (фиг.1C) в клетках и среде (фиг.1D) значительно снижалась при лечении IL-1 без цитотоксичности (фиг.1G). HBV cccDNA и HBV РНК также снижали в инфицированных клетках, обработанных IL-1β (фиг.1, E и F). IL-1β не уменьшал активность промотора ядра HBV, по меньшей мере, в клетках HepG2 (фиг.1H). Эти результаты свидетельствуют о том, что IL-1β подавляли инфекцию HBV в клетки HepaRG. IL-1β не уменьшал экспрессию таурохолата натрия toturocholate cotransporting polipptide (NTCP), недавно зарегистрированного рецептора входа HBV (данные не показаны) (55). Аналогичные результаты были получены с использованием первичных гепатоцитов человека (фиг.1I).

Подавление HBV-инфекции IL-1β.
A, верхний граф, клетки HepaRG предварительно обрабатывали цитокинами со 100 нг / мл (за исключением IFNα и IFNβ при 100 МЕ / мл) или гепарином в 25 единиц / мл в качестве положительного контроля или их не лечили (контроль) в течение 3 ч и затем инфицировали HBV в присутствии каждого стимула в течение 16 часов. После промывания клетки культивировали в нормальной среде роста в течение 12 дней. Белок HBs, секретируемый в среду, определяли количественно с помощью ELISA. Нижняя схема указывает на процедуру лечения клеток HepaRG. Черные и пунктирные линии показывают периоды с и без лечения соответственно. B-G и I, HepaRG-клетки (B-G) или PHH (I) обрабатывали, как показано в А, с или без 100 нг / мл IL-1 или 25 единиц / мл гепарина в качестве положительного контроля. Белок HBc в клетках (красный) был обнаружен методом косвенного иммунофлуоресценции, и ядро ​​окрашивали DAPI (синим) через 12 дней после инфицирования (B). ДНК HBV (C и I), cccDNA (E) и HBV (F) в клетках, а также ДНК HBV в среде (D). Жизнеспособность клеток определяли методом MTT (G). HBV (-) в I указывает на неинфицированные клетки. Все данные, за исключением I, основаны на среднем трех независимых экспериментах. Я показываю средние результаты по одному представительному эксперименту, но воспроизводимость данных подтверждена в трех независимых экспериментах. H, репортерную плазмиду, несущую промотор ядра HBV, трансфецировали клетками HepG2, а затем обрабатывали или без IL-1β (1, 10 и 100 нг / мл) и антагонистом рецептора ретиноида X HX531 в качестве положительного контроля в течение 6 часов. Была измерена активность люциферазы.

Как показано на фиг.2A, IL-1β подавляли инфекцию HBV дозозависимым образом. Этот эффект против HBV был отменен путем лечения с помощью нейтрализующего антитела к рецептору IL-1, IL-1RI (фиг.2B), что указывает на необходимость взаимодействия рецептора для анти-HBV-активности. IL-1Ra является естественным антагонистом, который ассоциируется с IL-1RI, но не вызывает нисходящую передачу сигнала (56). Лечение IL-1Ra не уменьшало инфекционную активность HBV (фиг.2C), предполагая, что для анти-HBV-активности требуется передача сигнала, инициированная IL-1.

Активация NF-κB, вызванная IL-1 и TNFα, была критической для анти-HBV-активности.
A-D, F и I клетки HepaRG оставались необработанными (контрольными) или обрабатывались с различными концентрациями IL-1β (1, 10, 30 и 100 нг / мл) или 25 единиц / мл гепарина (A), с 30 нг / мл IL-1β вместе с нейтрализующим антителом против IL-1RI или без него при 20 мкг / мл (B) с 10 нг / мл IL-1β или различными концентрациями IL-1Ra (10, 30 и 100 ng / ml) (C), с 3 нг / мл IL-1β вместе с PD98059, SP600125, SB203580 или Bay11-7082 (D) или QNZ или BMS-345541 (F) или без него или с TNFα (10, 100 и 300 нг / мл) (I) согласно графику обработки, показанному на фиг.1А. Инфекция HBV контролировалась секрецией белка HBs в среду в A, C, D, F и I и с белком HBc в клетках в активациях B. E, G и H, NF-κB (E и G) и ISRE (H) измеряли репортерным анализом в клетках, трансфицированных репортерной плазмидой, экспрессирующей люциферазу, из пяти тандемных повторов элементов NF-κB (E, верхний граф и G) или ISRE (H, верхний график) или посредством RT-PCR в клетках (E и H, нижние панели) на ингибиторах сигналов, используемых в D и F вместе с IL-1β (E и G) или без него, или на IL-1 (10, 30 и 100 нг / мл) или IFNα 100 МЕ / мл в качестве положительного контроля (H) в течение 6 часов. Белые и черные полосы на верхнем графике E и G показывают данные в отсутствие или присутствии IL-1β соответственно. В нижних панелях представлены полосы для мРНК для cIAP, XIAP и GAPDH (E) или ISG56, PKR или GAPDH (H). Все данные основаны на средних трех независимых экспериментах.

Чтобы идентифицировать путь передачи сигнала, необходимый для анти-HBV-активности, мы обработали клетки HepaRG PD98059, SP600125, SB203580 и Bay11-7082, которые являются ингибиторами для MEK, JNK, p38 и NF-κB соответственно (57). Как показано на фиг.2D, только обработка с помощью Bay11-7082 значительно удаляет анти-HBV-эффект IL-1β. Анализ люциферазы и анализ RT-PCR показали, что Bay11-7082, но не другие ингибиторы, блокировали трансактивацию NF-κB (фиг.2E, верхние панели) и гены NF-κB ниже, cIAP и XIAP (фиг.2E, нижние панели ). Дополнительные ингибиторы NF-kB, BMS-345541 и QNZ (фиг.2G) также инвертировали анти-HBV-эффект IL-1β (фиг.2F). Эти данные свидетельствуют о важной роли активации NF-κB в активности анти-HBV. Кроме того, IL-1β не увеличивал активность чувствительного к интерферону элемента (ISRE) и мРНК для ISG, ISG56 и двухцепочечной РНК-зависимой протеинкиназы (PKR) в клетках HepaRG (фиг.2Н), что указывает на то, что анти-HBV-активность не зависит от регуляции ISG. TNFα, еще один цитокин, который активирует сигнализацию NF-κB (фиг.2E, нижние панели), также ингибирует инфекцию HBV (фиг.2I). Таким образом, активация NF-κB в гепатоцитах хозяина была критической для анти-HBV-активности провоспалительных цитокинов.

Хотя гепарин, ингибитор присоединения, мог блокировать инфекцию HBV только при добавлении вместе с инокулятом HBV, предварительная обработка IL-1β до инфицирования HBV была достаточной для проявления активности против HBV (фиг.3A, панель b). Эта активность усиливалась длительным временем обработки до 12 ч (фиг.3В). Интригующе, клеточная ДНК HBV также была уменьшена обработкой IL-1β после инфекции HBV (фиг.3C, панель b). Напротив, IFNα неэффективен при предварительной обработке (фиг.3C, panel a и 1A), хотя он уменьшал ДНК HBV путем лечения после инфицирования HBV (фиг.3C, панель b), в соответствии с предыдущими сообщениями, что IFNα может подавлять HBV репликации (19, 20, 26). Таким образом, анти-HBV-активность IL-1β, вероятно, будет механически отличаться от активности IFNα.

Определение этапов жизненного цикла HBV, нацеленных на IL-1β.
A, HepaRG предварительно обрабатывали IL-1β или гепарином в течение 3 часов, а затем инфицировали HBV в присутствии (A, панель a) или отсутствие (A, панель b) IL-1β или гепарина в течение 16 часов. Инфекция HBV контролировалась секрецией белка HBs из инфицированных клеток. Только предварительная обработка IL-1β, а не гепарином может ингибировать инфекционную активность HBV. д, день. B, HepaRG предварительно обрабатывали IL-1β или оставляли необработанным (-) в течение указанного времени (h) и инфицировали HBV без IL-1β. Активность анти-HBV усиливалась длительным временем лечения. C, панель a, клетки HepaRG предварительно обрабатывали 10 нг / мл IL-1β, 100 МЕ / мл IFNα или 1 мкм ламивудином в течение 3 ч с последующим инфицированием HBV в течение 16 часов в отсутствие цитокинов (предварительная обработка). C, панель b, клетки HepaRG инфицировали HBV в течение 16 ч без предварительной обработки. После промывки входного вируса клетки культивировали в нормальной среде в течение первых 8 дней, а затем культивировали с IL-1β, IFNα или ламивудином в течение следующих 4 дней (после лечения). ДНК HBV в клетках измеряли ПЦР в реальном времени. IL-1β показал активность анти-HBV как при предварительной обработке, так и после лечения, хотя эффект против HBV IFNα наблюдался только после лечения. D, HepAD38 обрабатывали 100 нг / мл IL-1β или 1 мкм ламивудином или оставляли без лечения в течение 6 дней в отсутствие тетрациклина. Репликацию HBV оценивали путем измерения ДНК HBV в среде. E, HepaRG предварительно обрабатывали IL-1β, ламивудином или гепарином в течение 3 ч или оставляли необработанными и инфицировали HBV в течение 16 часов в присутствии или в отсутствие каждого соединения. После трипсинизации и интенсивной промывки клеток клеточная ДНК сразу же восстанавливалась для обнаружения ДНК HBV. ДНК HBV через 16 ч после инфицирования уменьшалась при лечении IL-1β, но не ламивудином.

Жизненный цикл HBV можно разделить на по меньшей мере две фазы следующим образом: 1) ранняя фаза заражения, которая включает в себя прикрепление, вход, ядерный импорт и образование cccDNA; и 2) поздняя фаза, представляющая репликацию HBV, включая транскрипцию, сборку, обратную транскрипцию, синтез ДНК и вирусное высвобождение (58). Ранняя фаза заражения HBV не поддерживается, но ДНК HBV настойчиво реплицируются в клетках HepAD38 в присутствии тетрациклина (38). IL-1β уменьшал уровни ДНК HBV в клетках HepAD38 (рис. 3D), что указывало на подавление репликации HBV. Кроме того, для изучения ранней фазы, предшествующей репликации HBV, мы инфицировали клетки HepaRG HBV в присутствии IL-1 в течение 16 часов, а затем сразу же выделили клеточную ДНК в трипсинированных клетках для количественной оценки ДНК HBV (фиг.3E). Эта процедура, вероятно, обнаружила ДНК HBV, которая была интернализована и уклонилась от ограничения хозяина до начала репликации HBV, потому что ламивудин не оказывал никакого влияния на количество обнаруженной ДНК (фиг.3Е). В этом эксперименте IL-1β значительно уменьшал ДНК HBV (фиг.3Е). cccDNA также уменьшалась с помощью IL-1β, предполагая, что ранняя фаза заражения HBV до образования cccDNA также прерывалась IL-1β.

Врожденный иммунный путь против инфекции HBV остается в значительной степени неизвестным. Недавно накопленные данные показали, что несколько белков семейства APOBEC, особенно A3G, подавляют репликацию HBV при сверхэкспрессии (27-33). Напротив, не было никакого отчета, предлагающего функцию анти-HBV других факторов ограничения против ВИЧ, TRIM5α, тетерин / BST-2 и SAMHD1. Затем мы исследовали белки семейства APOBEC в качестве кандидата для эффектора против HBV. Семейство APOBEC включает APOBEC1 (A1), A2, A3s, A4 и AID (59). Поскольку некоторые из этих белков, как сообщается, были отрегулированы в цитокин-стимулированных гепатоцитах (27, 28, 60, 61), мы исследовали экспрессию этих генов в клетках, обработанных IL-1β, TNFα и IFNα в качестве контроля для 12 ч. Уровни мРНК A1, A2 и A3A были ниже порога обнаружения. A3G и A3F мРНК были достоверно экспрессированы в клетках HepaRG, и их уровни экспрессии были значительно увеличены обработкой IFNα (фиг.4A), как это было отмечено в других отчетах (27, 28, 61). IL-1β и TNFα не оказывали существенного влияния на A3s, и только AID повышалась в 6-10 раз обоими цитокинами (фиг.4A). Индукция A3s как IL-1β, так и TNFα не наблюдалась в любой момент времени до 12 часов (данные не показаны). Напротив, индукция мРНК AID IL-1β и TNFα была сохранена в клеточных линиях клеток гепатоцитов человека, таких как клетки HepG2 и FLC4, и в первичных человеческих гепатоцитах (фиг.4B). Производство белков AID также увеличивалось в первичных гепатоцитах человека путем обработки IL-1β и TNFα (фиг.4C). Предполагается, что эта индукция AID IL-1β является зависимой от NF-κB, потому что повышение регуляции мРНК AID было отменено добавлением ингибиторов NF-κB, Bay11-7082 или QNZ (фиг.4D).

Экспрессия AID индуцировалась IL-1β и TNFα.
A, мРНК для A3B, -C, -D, -F, -G, -H и AID количественно определяли методом RT-PCR в реальном времени в клетках HepaRG, обработанных 100 нг / мл IL-1β, 100 нг / мл TNFα, или 100 МЕ / мл IFNα в течение 12 ч или без обработки. Графики показывают относительные уровни экспрессии по сравнению с контрольными наборами, установленными на 1. B, AID мРНК была обнаружена в клетках HepG2, FLC4 и PHH, обработанных IL-1β, TNFα или IFNα или оставленных без лечения. Индукция AID IL-1β и TNFα наблюдалась в клетках HepG2 и FLC4 и первичных человеческих гепатоцитах. C, белок AID (верхняя панель) и уровни актина в качестве внутреннего контроля (нижняя панель) были исследованы иммуноблотом первичных человеческих гепатоцитов, обработанных IL-1β или TNFα, или оставленных без лечения. D, AID мРНК была обнаружена в PHH, обработанном 100 нг / мл IL-1β в присутствии или в отсутствие ингибиторов NF-κB, Bay11-7082 или QNZ в течение 12 часов.

Чтобы исследовать функцию AID при инфицировании HBV, мы трансформировали AID эктопически в клетки HepaRG с использованием лентивирусного вектора (фиг.5A, левая панель). Восприимчивость этих AES-сверхэкспрессирующих клеток к HBV уменьшалась примерно на одну треть по сравнению с родительскими или пустыми трансформированными вектором клетками HepaRG (фиг.5A, правая панель), предполагая, что AID может ограничивать инфекцию HBV. AID-мутант AID (M139V) с сообщенной уменьшенной активностью для поддержки переключения классов (48) также уменьшал восприимчивость к инфекции HBV, хотя снижение восприимчивости HBV было умеренным по сравнению со случаем AID дикого типа (фиг.5B) ,

AID играет значительную роль в IL-1-опосредованной анти-HBV-активности.
A и B, левые панели, клетки HepaRG были трансдуцированы лентивирусным вектором, несущим экспрессионную плазмиду для AID (RG-AID), мутанта AID (M139V) (RG-AID (M139V)) (B) или контрольного вектора (RG -EV). Экспрессию белка для AID (верхняя панель) и актина (нижняя панель) в этих клетках, родительские клетки HepaRG (HepaRG) и те, которые временно трансфицированы с помощью экспрессионной плазмиды AID (Aex overexpression) (A), были исследованы иммуноблоттом. Правые панели, эти клетки были инфицированы HBV с последующим обнаружением секретируемого белка HBs, как показано на фиг.1A. AID-трансдуцированные клетки были менее восприимчивы к инфекции HBV. C, HepaRG трансдуцировали лентивирусным вектором, несущим shRNAs для AID (RG-shAID # 1 и RG-shAID # 2) или для циклофилина A (RG-shCyPA) в качестве контроля. AID mRNA (левая панель) и белок (правая панель) были определены количественно в режиме реального времени RT-PCR и иммуноблот-анализа. D, клетки, продуцируемые в C, были инфицированы HBV в отсутствие или в присутствии IL-1β или гепарина, а HBs были обнаружены в среде, как на фиг.1A, для изучения анти-HBV-эффекта IL-1β и гепарина. Снижение уровня HBV-инфекции путем лечения IL-1β показано как анти-HBV IL-1β над графиком. Белые, серые и черные полосы указывают значение HB клеток без лечения и лечение гепарином и IL-1β соответственно. Активность анти-HBV IL-1β, но не гепарина, снижалась в клетках с нокаутом AID. E, AID и его мутант подавляют репликацию HBV. Клетки HepG2 были подвергнуты транскрипции с помощью GID-метки AID, AID (H56Y), A3G и GFP, а также с HBV-кодирующей плазмидой. Через 3 дня определяли количественно ДНК HBV цитоплазмы нуклеокапсида (верхний график), и были обнаружены сверхэкспрессированные белки, а также актин (нижние панели). F, лентивирусные векторы, несущие AID, AID (M139V) мутант, A3G или пустой вектор (пустой вектор), были трансдуцированы или оставлены без трансдукции (без трансдукции) в клетки HepG2.2.15. Связанная с нуклеокапсидом ДНК HBV в этих клетках или в клетках HepG2 (HBV-) была обнаружена Саузерн-блот (верхняя панель). Иммуноблот также выявляли AID (средняя панель) и белок A3G (нижняя панель). G, HBV взаимодействовали с AID. Клетки HepAD38, трансдуцированные без (без трансдукции) или с вектором AID-экспрессии или пустым вектором (пустой вектор), лизировали и обрабатывали анти-ядерным антителом (1-я панель) или контролировали нормальный IgG (2-я панель) для иммунопреципитации (IP). Суммарная фракция без иммунопреципитации (3-я и 5-я панели) также была восстановлена ​​для обнаружения AID (1-я-3-я панели), ядро ​​HBV (5-я панель) и актина (5-я панель) с помощью иммуноблота. WB, Вестерн-блот. H, HBV РНК в частицах ядра экстрагировали, как показано в разделе «Экспериментальные процедуры» в клетках HepG2, сверхэкспрессирующих ДНК HBV вместе с AID или A3G или без них.

Чтобы исследовать релевантность эндогенной АД в анти-HBV-активности IL-1, мы трансфицировали лентивирусный вектор, несущий короткую шпилечную РНК (shRNA) против AID (sh-AID) или нерелевантный белковый циклофилин A (фиг.5C), и мы наблюдали анти-HBV-активность IL-1β в этих клетках. IL-1β уменьшал HBV-инфекцию в контрольных и sh-cyclophilin A-трансмузированных клетках в ~ 3,0 раза, как определено секрецией HBs (фиг.5D, дорожки 1 и 2, черные полосы). Напротив, анти-HBV-активность IL-1β была ограничена только 1,6-1,7 раза в клетках, трансдуцированных sh-AID (фиг.5D, полосы 3 и 4, черные полосы). Такая облегченная анти-HBV активность после нокдауна AID не наблюдалась в случае лечения гепарином (фиг.5D, полосы 1-4, серая полоса). Аналогичные результаты были получены путем мониторинга внутриклеточной ДНК HBV после инфицирования (данные не показаны). Хотя анти-HBV-эффект IL-1β не был полностью затуплен, эти данные свидетельствуют о том, что AID играет значительную роль в опосредовании анти-HBV-эффекта IL-1β.

Аналогичные наблюдения были получены в HBV-реплицирующихся клетках, сверхэкспрессирующих AID (фиг.5, E и F). Связанная с ядрами ДНК HBV в клетках HepG2, трансфецированных HBV-кодирующей плазмидой, была уменьшена путем сверхэкспрессии с помощью AID, а также с A3G (фиг.5E, дорожки 1 и 3). Интригующе, что ДНК HBV в частицах ядра также уменьшалась экспрессией AID-мутанта AID (H56Y), который содержит мутацию в мотиве цитидиндезаминазы и получен из пациента с дефицитом класса (рис.5E, полоса 2) (48) , Саузерн-блоттинг также показал, что уровень гДНК HBV в клетках HepG2.2.15 был снижен путем трансдукции с помощью AID и другого мутантного AID (M139V) с уменьшенной активностью для поддержки переключения класса (фиг.5F) (48). Эти данные свидетельствуют о том, что AID может подавлять репликацию HBV, и эта рестрикционная активность может наблюдаться при уменьшенной ферментативной активности. Кроме того, было показано, что AID взаимодействует с белком ядра HBV с помощью анализа коиммунопреципитации (фиг.5G). Более того, избыточная экспрессия AID уменьшала уровни для нуклеокапсид-ассоциированной РНК HBV (фиг.5H). Эти результаты также указывают на противовирусную активность AID против репликации HBV.

Основной ферментативной активностью для белков семейства APOBEC является введение гипермутации в ДНК-мишени / РНК, а гипермутация объясняет антивирусную активность A3G против ВИЧ-1 в некоторой степени (2). Несколько групп сообщили, что белки семейства APOBEC могут индуцировать гипермутацию в ДНК HBV (27, 30, 32, 34). Затем мы спросили, может ли AID индуцировать гипермутации в ДНК HBV. В дифференциальном анализе ДНААЦИИ ДНК денатурации высокое содержание оснований А / Т, введенное гипермутацией, уменьшало температуры денатурации (51). Как показано на фиг.6А, эктопическая экспрессия AID уменьшала температуру денатурации ДНК HBV, как показано на рисунке А3G. Последовательный анализ области ХВВ ДНК Х, амплифицированной при 83 ° С с помощью дифференциальной ДНК-денатурации ПЦР, показал массивное накопление G-to-A мутаций с помощью AID (фиг.6В). Частота мутаций G-to-A была дополнена экспрессией AID (фиг.6C). В этом эксперименте AID (JP8Bdel), гиперактивный мутант AID (62), дополнительно способствовал накоплению мутаций G-to-A и C-to-T, хотя AID (H56Y) показал мутации в эквиваленте ДНК HBV с ложным контрольным образцом GFP (рис.6C). Таким образом, AID имел потенциал для введения гипермутации в нуклеокапсид-ассоциированной ДНК HBV.

AID может вызвать гипермутацию ДНК HBV.
A и B, HepG2 клетки были подвергнуты трансплантации экспрессионным вектором для GFP-помеченного AID, HA-помеченного A3G или GFP вместе с HBV-кодирующей плазмидой. Через 3 дня после трансфекции экстрагировали нуклеокапсидсвязывающую ДНК HBV и проводили дифференциальную ДНК-денатурацию ПЦР для амплификации сегментов гена X. Числа над панелями в A показывают денатурирующие температуры. Фрагмент X-гена, амплифицированный при 83 ° C в образце AID, клонировали в T-вектор и секвенировали в B. Выделяли независимые пять клонов с эталонной последовательностью (X02763). C, AID и его мутант (JP8Bdel) индуцировали гипермутации G-to-A и C-to-T в ДНК HBV. Клетки HepG2 трансфицировали векторами экспрессии GID-меченых AID, AID (H56Y), AID (JP8Bdel) или самим GFP вместе с HBV-кодирующей плазмидой. Через три дня после трансфекции клетки собирали, а ДНК-HBV-ассоциированную нуклеокапсидом экстрагировали. Х-фрагменты гена амплифицировали при 94 ° С и клонировали в Т-векторе. 55 клонов были секвенированы, как описано в разделе «Экспериментальные процедуры». Цифры указывают номера клонов, несущих мутацию. D, экспрессия GFP, AID с меткой GFP, AID (H56Y) и AID (JP8Bdel) показана иммуноблотом.

Мы исследовали, может ли противовирусная активность IL-1β и TNFα быть обобщена на другие вирусы или специфична для HBV. Как показано на фиг.7А, продуцирование инфекционных белков ядра HCV и HCV в среде не было существенно изменено путем обработки этими цитокинами в клетках, инфицированных HCV, по сравнению с тем, когда IFNα использовали в качестве положительного контроля (фиг.7A). Напротив, IL-1 подавлял инфекцию генотипа HBV A и C в клетки HepaRG (фиг.7B), а также генотип D (фиг.1C). Эти данные свидетельствуют о том, что противовирусная активность провоспалительных цитокинов IL-1 и TNFα специфична для HBV.

Антивирусная активность AID была специфичной для HBV.
A, Huh-7.5.1 предварительно обрабатывали IL-1β, TNFα или IFNα в течение 3 ч или оставляли необработанными, а затем совпадали с HCV в течение 4 часов. После промывания HCV и цитокинов и культивирования клеток с нормальной средой в течение 72 часов определяли количественную оценку инфекционности HCV (левая панель), а также белка ядра HCV (правая панель) в среде. B, HepaRG-клетки обрабатывали IL-1β или гепарином или оставляли необработанными в течение 3 ч до и 16 ч во время инфицирования генотипа HBV A (левый график) или C (правый график), как показано на фиг.1A. HBV-инфекцию контролировали с помощью клеточной ДНК HBV через 12 дней после инфицирования, как показано на фиг.1C.

В этом исследовании скрининг цитокинов показал, что IL-1 и TNF уменьшают восприимчивость клеток-хозяев к инфекции HBV. Этот антивирусный механизм довольно уникален, учитывая, что внутриклеточный иммунный ответ против вирусов обычно запускается IFN. До сих пор сообщалось, что IFN типа I, II и III подавляют этап репликации жизненного цикла HBV (19, 20, 25, 26). Напротив, мы предполагаем, что IL-1 и TNFα ингибируют раннюю фазу заражения HBV, а также репликацию. Это согласуется с кумулятивными клиническими данными, свидетельствующими о том, что эти провоспалительные цитокины способствуют элиминации HBV (63-65). IL-1 и TNFα обычно получают главным образом в макрофагах, а также в других типах клеток, включая Т-клетки и эндотелиальные клетки (66). Хотя основные клетки-продуценты этих цитокинов у пациентов с гепатитом В не определены, сообщалось, что секреция IL-1 и TNFα в непаренхимных клетках была увеличена за счет инфицирования HBV в гепатоцитах (67). Получение TNFα в макрофагах было дополнено добавлением рекомбинантного HBc (68). Ряд клинических исследований кумулятивно показывает, что уровни IL-1 и TNFα в сыворотке увеличиваются у пациентов с гепатитом B (12). Недавно была значительная клиническая проблема, которую HBV реактивирует в ходе лечения иммунодепрессантами, такими как анти-TNFα-агенты (64, 65). В совокупности предлагается, чтобы острая или хроническая инфекция HBV индуцировала IL-1 / TNFα из макрофагов или других клеток в печени инфицированных пациентов, которые могут непосредственно подавлять инфекцию HBV в гепатоцитах, в дополнение к их иммуномодулирующим эффектам для иммунных клеток хозяина , Хотя уровень IL-1 у пациентов с HBV-инфицированным варьируется между документами, Daniels et al. (63) сообщили, что пиковый уровень IL-1β у пациентов с HBV-инфекцией составил 9-36 нг / мл при стимуляции Toll-подобного рецептора, при котором концентрация IL-1β показала значительные эффекты против HBV в этом исследовании. В общем, нижестоящие гены NF-κB включают ряд противовирусных факторов, таких как viperin, iNOS и RANTES (69). Хотя некоторые из этих генов могут функционировать совместно для IL-1-и TNF-индуцированных анти-HBV-аппаратов, наши данные свидетельствуют о том, что AID, по крайней мере частично, играет роль в элиминации HBV, которая была потенцирована провоспалительными цитокинами IL-1 и TNFα.

AID относится к белкам семейства APOBEC, которые делят ферментативную активность с целью превращения цитидина в урацил в основном ДНК, а иногда и РНК (51, 70, 71). Хотя AID был первоначально идентифицирован в В-клетках, хроническое воспаление может вызвать его экспрессию в гепатоцитах (60). Сообщается, что индукция AID опосредована NF-κB (60), что согласуется с результатами этого исследования. Хотя AID в B-клетках имеет важное значение для рекомбинации кластерного класса и соматической гипермутации генов иммуноглобулина (70, 72), физиологическая роль AID в гепатоцитах неизвестна. Хотя экспрессия AID в гепатоцитах все еще ниже, чем в В-клетках, AID, как сообщается, выражается в печени как в культуре клеток, так и в условиях in vivo (34, 60). Наши результаты поднимают идею о том, что AID играет роль в врожденном противовирусном иммунитете. AID также играет роль в патогенезе, вызванном вирусом, поскольку сообщалось, что он противодействует онкогенезу, вызванному вирусом абелсон-мышиного лейкоза (73). Кроме того, сообщалось, что AID ограничивает ретротранспозицию L1, которая может предсказать роль AID в врожденном иммунитете (74). Это исследование имеет большое значение в том, что оно выявило биологическую функцию AID в самой вирусной инфекции, связывая ее с ограничением патогенного вируса человека. Будет интересно проанализировать роль AID в процессе заражения другими вирусами в будущем.

Хотя механизм подавления AID жизненного цикла HBV является предметом будущего исследования, AID, возможно, нацелен на раннюю фазу заражения HBV, включая вход, а также стадию репликации, включая сборку и обратную транскрипцию (фиг.3). Недавно сообщалось, что курица AID уменьшала cccDNA утиного HBV, возможно, путем нацеливания на cccDNA, а также на нуклеокапсид-ассоциированную ДНК HBV (75). Это исследование, вероятно, подтвердит идею о том, что AID может мигрировать cccDNA, образованную после входа HBV в гепатоциты, а также ассоциируется с нуклеокапсид-ассоциированной ДНК HBV при репликации HBV, хотя неясно, сохраняется ли врожденная иммунная система против HBV / утиного HBV в клетках человека и курицы. A3G блокировал репликацию HBV через ингибирование обратной транскриптазы (29), упаковку прегеномной РНК (33) и дестабилизацию упакованной предгеномной РНК (31) независимо от ее активности дезаминазы, а также индуцировал гипермутацию ДНК HBV (27, 30 , 32, 34). Недавно сообщалось, что AID упаковывается в нуклеокапсид HBV (51). Более того, AID индуцировала гипермутации C-to-T и G-to-A в ДНК / РНК HBV, хотя активность анти-HBV пока не была продемонстрирована (51). Гипермутационная активность AID, вероятно, не пригодна для его функции репликации против HBV (фиг.5 и 6), как сообщалось для APOBEC3G несколькими группами (29, 30, 33). Дальнейший анализ необходим для выяснения точных механизмов опосредованного AID подавления жизненного цикла HBV.

В заключение мы определили, что восприимчивость клеток-хозяев к инфекции HBV модулируется IL-1 и TNFα, и AID участвует в этом оборудовании. Это проливает новый свет на связь между провоспалительными цитокинами и развитием врожденной противовирусной защиты.

Эта работа была поддержана грантами в виде помощи от Министерства здравоохранения, труда и благосостояния, Японии, Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий, Японии и Японского общества поощрения науки и стимулирования поддержку со стороны Исследовательского фонда вирусных гепатитов в Японии.

Используемые сокращения:
A3GAPOBEC3G

активационно-индуцированная цитидиндезаминаза

вирус гепатита В

вирус гепатита С

IFN-стимулированный ген

6-амино-4- (4-phenoxyphenylethylamino) хиназолин

эквивалент генома

первичный гепатоцит человека

3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид

чувствительный к интерферону элемент

ковалентно замкнутой кольцевой ДНК.

Клетки HepAD38, HepG2.2.15 и Huh-7.5.1 были любезно предоставлены доктором Сигером в Центре рака Fox Chase, доктором Урбаном в Университете Гейдельберга и доктором Chisari в Научно-исследовательском институте Scripps. Мы благодарны М. Мацуде, Т. Дате, Т. Мизогучи, Я. Хираме, М. Сасаки, Х. Аояги и С. Накаджима за техническую и секретарскую помощь. Мы также благодарим доктора Ишиду в PhoenixBio, доктора Сугиямы в Национальном центре глобального здравоохранения и медицины, а также всех сотрудников Департамента вирусологии II, Национального института инфекционных заболеваний, за их полезные обсуждения.



Источник: rupubmed.com


Добавить комментарий