Производство тест системы гепатит в

Производство тест системы гепатит в


Транскрипт

1 ДИАГНОСТИКА ГЕПАТИТА В ИНФОРМАЦИОННЫЕ МАТЕРИАЛЫ НИЖНИЙ НОВГОРОД 2007

2 Иголкина С.Н., технолог отдела по производству тест-систем для выявления маркеров гепатита В Шарипова И.Н., старший научный сотрудник отдела генно-инженерной биотехнологии Уланова Т.И., д.б.н., директор по науке Бурков А.Н., д.м.н., профессор, генеральный директор ООО «НПО «Диагностические системы»

3 СОДЕРЖАНИЕ Эпидемиология вирусного гепатита В 4 Мутанты вируса гепатита В 6 Маркеры вируса гепатита В 6 «ДС-ИФА-HBsAg» 14 «ИФА-АНТИ-НВс-М-СКРИН» 17 «ДС-ИФА-АНТИ-НВс» 18 «ДС-ИФА-НВеAg» 18 «ДС-ИФА-АНТИ-НВe» 21 «ДС-ИФА-АНТИ-НВs» 22 Литература 23 3

4 ДИАГНОСТИКА ГЕПАТИТА В Гепатит В (ГВ) является одним из самых распространенных и опасных вирусных инфекционных заболеваний человека, что обусловлено высокой устойчивостью возбудителя во внешней среде и широким спектром клинико-эпидемиологических особенностей. Истинная распространенность гепатита В значительно превышает регистрируемую заболеваемость. Большое число лиц, инфицированных вирусом ГВ, становятся хроническими носителями этого вируса и резервуаром инфекции, иногда не подозревая об этом. ГВ опасен не только тяжестью течения, высокой летальностью, но и развитием хронических форм с переходом в цирроз и первичную карциному печени, особенно у лиц, которые были инфицированы в раннем детстве. Россия относится к регионам с высоким уровнем распространенности ГВ, что представляет реальную угрозу для здоровья населения. В конце 90-х годов наблюдался выраженный подъём заболеваемости ГВ, при этом неуклонно возрастало число носителей возбудителя. В последние годы существенно изменилась возрастная структура заболевших ГВ, среди которых от 70 до 80% составляют лица в возрасте от 15 до 29 лет, что обусловлено парентеральным употреблением наркотических веществ. (Онищенко, 2003). Эффективных специфических средств лечения ГВ нет. Единственным действенным способом борьбы с ним является массовая профилактическая вакцинация населения. Благодаря внедрению национальной программы вакцинации, начиная с 2001 года наметилась некоторая тенденция к снижению заболеваемости ГВ. Повсеместное использование одноразового медицинского инструментария, исследование образцов сывороток крови на маркеры ГВ с помощью высокочувствительных методов третьего поколения также вносят существенный вклад в дело борьбы с ГВ. Однако, несмотря на принимаемые меры, эпидемическая ситуация с ГВ остается достаточно серьезной и требует постоянного расширения и совершенствования профилактических мероприятий. Эпидемиология вирусного гепатита В Вирусный гепатит В — инфекционное заболевание, которое характеризуется тяжелым воспалительным поражением печени (Tiollais, 1985; Ganem, 1987). Формы болезни — от носительсгва вируса до острой печеночной недостаточности, цирроза и рака печени. Исход заболевания определяется особенностями иммунного статуса и возрастом заболевшего. Источниками возбудителя инфекции являются больные острыми и хроническими формами болезни, а также лица с субклиническим течением инфекционного процесса и здоровые носители. Больные становятся инфекционно опасными с конца инкубационного периода. Как носители вируса, так и больные хроническими ГВ могут сохранять эпидемическое значение в течение всей жизни. ГВ передается через кровь и контактным, преимущественно половым путем. Большому риску подвергаются медики, имеющие частые контакты с кровью. Вирус может передаваться от матери к ребенку во время беременности или непосредственно при родах. 4

5 ИНФОРМАЦИОННЫЕ МАТЕРИАЛЫ До 80% новых случаев заражения ГВ связано с внутривенным употреблением наркотиков. Реализации путей передачи инфекции способствует продолжительная и интенсивная вирусемия у источников инфекции, часто не имеющих внешних признаков болезни. Для эффективного заражения достаточно 10-5 мл инфицированной сыворотки крови. При ГВ отсутствуют сезонные подъемы заболеваемости. Регистрируются как спорадические случаи, так и вспышки ГВ. Лица, перенесшие гепатит В и имеющие антитела к поверхностному антигену вируса (анти-hbs), повторно не заражаются. ВГВ высокоустойчив к внешним воздействиям. В условиях комнатной температуры вирус сохраняется 3 месяца, в холодильнике 6 месяцев, в замороженном виде лет, в высушенной плазме — 25 лет. Вирус теряет инфекционность при автоклавировании при температуре С через 45 минут, при стерилизации сухим паром — в течение 60 мин при С или при кипячении в течение 30 минут. Показателем широты распространения ВГВ служит выявления поверхностного антигена ВГВ (HBsAg) и антител к cor-антигену ВГВ. Выделяют регионы с низкой (менее 2% населения) (Северная, Западная, Центральная Европа, Австралия, Северная Америка), со средней (2-8% населения) (Восточная Европа, Россия и др.) и высокой (8-20% населения) частотой носительства HBsAg (Юго-Восточная Азия, тропическая Африка и др.) (рис. 1). Рисунок 1 Географическая распространенность гепатита В > 8 % Высокая 2 8% Средняя < 2% Низкая 5

6 ДИАГНОСТИКА ГЕПАТИТА В Мутанты вируса гепатита В Мутанты ВГВ — варианты вируса гепатита В, отличающиеся от прототипных штаммов ВГВ нуклеотиднымй последовательностями ДНК (Ющук, Климова, 2000). Возможность выявления мутантов появилась после разработки методов генной инженерии, позволяющих определить нуклеотидную последовательность генома различных изолятов вируса. ВГВ обладает высокой генетической вариабельностью из-за наличия в цикле репликации этапа обратной транскрипции с образованием прогенома. Большинство мутаций не вызывают изменений свойств вируса, его антигенов или течения инфекционного процесса. Однако, выявлены мутантные штаммы, которые ассоциируются с такими изменениями. Мутации, происходящие в ДНК ВГВ, могут привести к модификации или элиминации эпитопов, изменению действия белков вируса на инфицированные гепатоциты, изменению репликации ДНК, сборки вирусных частиц и секреции вирусных белков. С наличием множественных мутаций в различных генах ВГВ связывают случаи обнаружения ДНК ВГВ в печени больных острым и хроническим ГВ при отрицательных результатах тестирования серологических маркеров инфицирования вирусом. Заболевание, вызванное мутантами ВГВ, может протекать с быстрой хронизацией или фульминантно. В настоящее время описаны мутации всех 4 генов ВГВ. Маркеры вируса гепатита В Антигены ВГВ совместно с вырабатывающимися на них антителами представляют комплекс специфических маркеров ГВ, индикация которых имеет важное диагностическое, прогностическое, клиническое и эпидемиологическое значение. Поверхностный антиген ВГВ (HBsAg) составляет наружную оболочку ВГВ (Холмс, 1989) и синтезируется в цитоплазме гепатоцитов обычно в избытке. Небольшое его количество участвует в формировании новых вирусных частиц, а остальная часть секретируется в межклеточное пространство и поступает в кровь. Концентрация HBsAg в крови колеблется от нескольких пикограмм до сотен микрограмм и иногда приближается к концентрации нормальных сывороточных белков. По химическому составу HBsAg состоит из белков, гликопротеидов, липопротеидов и липидов (до 30% от общего состава) клеточного происхождения. Средняя молекулярная масса частиц HBsAg/adv от 3,7 до 4,6 kd (Chairez, 1975), константа седиментации колеблется от 39 S до 54 S. Частица HBsAg состоит из нескольких сотен молекул белков. HBsAg является серологически гетерогенным и представляет собой сложный антигенный комплекс, в состав которого входят несколько антигенных детерминант: «а» — общая группоспецифическая детерминанта, «у» или «d», «r» или «w» — две пары аллельных или подтиповых детерминант. Известны антигенная гетерогенность w- детерминант и добавочные детерминанты, такие как q, х или g (Courouse-Pauty, 1974; Courouse, 1975). Сочетание антигенных детерминант HBsAg определяет его субтипы. Выявлено десять основных субтипов антиге- 6

7 ИНФОРМАЦИОННЫЕ МАТЕРИАЛЫ на: ayw 1, ayw 2, ayw 3, ayw 4, ayr, adw 2, adw 4, adr, adrq+, adrq- (Courouse, 1975; Козловская 1986). Встречаются сообщения о выделении на Дальнем Востоке необычных субтипов детерминант HBsAg (awr, adwr, adyw, adyr, adywr) (Courouse, 1975). До настоящего времени не обнаружена корреляция между видом субтипа и тяжестью заболевания, его течением или хронизацией острого ГВ. Указанные иммунологические варианты детерминированы изменением в S-гене. При изучении уровня распространения субтипов в различных географических регионах мира было установлено, что на конкретных территориях наблюдается превалирование одного из них. По этому признаку вся территория земного шара разделена на четыре зоны. — Зона «Y» (HBsAg/ау) — Средний Восток, Иран, Пакистан, Южно-Европейские страны, Африка. Частота выявления HBsAg субтипа ау в России, Украине и Узбекистане составляет 65-98%; в Литве, Латвии, Молдове %. — Зона «D» (HBsAg/аdw) — Северные и Центральные районы Европы, Америки и Африки, Таиланд, Индонезия, Гвинея. — Зона «R» (НВsАg/adr) — Юго-Восточная Азия (Китай, Япония, Корея), Дальний Восток. — Смешанная зона — центральные зоны Океании. Поскольку каждый субтип ассоциируется с конкретными географическими районами, их определение имеет большое значение в эпидемиологическом плане. Общая группоспецифическая «а»-детерминанта HBsAg состоит из двух гидрофильных регионов («петель») (рис. 2). В зонах «петель» происходят замены, обусловленные точечными мутациями ДНК-региона ВГВ, кодирующего «а»-детерминанту. Аминокислотная Рисунок 2 Структурная модель детерминанты а 7

8 ДИАГНОСТИКА ГЕПАТИТА В Рисунок 3 Степень реактивности различных субтипов диких и мутантных форм HBsAg в тест-системе «ДС-ИФА-HBsAg» S/CO IU/ml ad: дикий тип Мутации в 1 петле Мутации в 2 петле ay: дикий тип Мутации в 1 петле adr adw 2 Q 129 H T 126 S mut 126 mut 133 L T 143 K p 142 S ayw 1 Q 129 R Q 129 L гетерогенность «а» — детерминанты HBsAg может оказывать существенное влияние на его антигенные свойства. На рисунке 3 представлены результаты исследования иммунореактивности различных субтипов диких и мутантных форм HBsAg. Дикие типы — adr и adw2 в отличие от мутантных выявляются в ИФА с более высокими показателями оптической плотности. Мутации во второй петле ( ак) HBsAg приводят к более значительному снижению реактивности (степени реагирования) HBsAg с антителами, чем мутации в первой петле ( ак). При концентрации HBsAg 0,1 МЕ/мл выявляются 8

9 ИНФОРМАЦИОННЫЕ МАТЕРИАЛЫ только дикие формы HBsAg и один из вариантов субтипа ау с мутацией в первой петле (Q129R). Следовательно, мутации во второй петле детерминанты «а» оказывают большее влияние на антигенную структуру HBsAg, чем мутации, возникающие в первой петле. Детерминанта «а» является основной мишенью для нейтрализующих антител, поэтому иммунизация не всегда дает защиту против вариантов ВГВ, имеющих аминокислотные замены внутри этого региона (Zuckerman, 2000). Всеобщая вакцинация ускорила накопление мутантов по «а» детерминанте HBsAg, т. е. изменение аминокислотных последовательностей, критичных для иммунного ускользания у вакцинированных, что привело к необходимости разработки новых стратегий вакцинации. HBsAg является основным серологическим маркером ВГВ, свидетельствующим о возможном его присутствии при острой или хронической инфекции или носительстве вируса. Он играет ключевую роль в диагностике и изучении этиологии, патогенеза, клиники и профилактики этой инфекции (Михайлов, 1988). При установлении этиологического диагноза ГВ HBsAg может быть первым маркером инфекции и служить одним из основных индикаторов для постановки диагноза. HBsAg появляется в крови через 1-2 недели после инфицирования, т.е. может быть обнаружен в инкубационном периоде до появления клинических симптомов, иногда одновременно с вирусной ДНК, ДНК-полимеразой и несколько опережает появление HBsAg. Концентрация HBsAg в этот период может быть очень незначительной. При дальнейшем развитии инфекции концентрация HBsAg существенно увеличивается вместе с подъемом активности АЛАТ и в период разгара болезни достигает мкг в 1 мл крови. Момент появления HBsAg в крови зависит от инфицирующей дозы вируса, индивидуальных особенностей иммунной системы организма. Раннее выявление HBsAg может соответствовать высокой инфицирующей дозе, например, при посттрансфузионном гепатите, а преимущественная продолжительность циркуляции — более высокой исходной концентрации, а также тяжести течения заболевания. Если в процессе развития заболевания HBsAg перестает обнаруживаться в крови, это не обязательно соответствует полной санации организма и выздоровлению. У части больных в крови присутствует ВГВ-ДНК, что характеризует их потенциальную эпидемическую опасность (Elghouzzi, 1995). С другой стороны, обнаружение HBsAg не обязательно свидетельствует об инфекционной опасности больного, т.к. он не является маркером активной репликации ВГВ (Соринсон, 1997). При проведении динамического контроля за заболеванием HBsAg может служить маркером, позволяющим прогнозировать течение инфекции. При исходных низких титрах HBsAg у больных острым ГВ продолжительность его циркуляции обычно не превышает 30 дней, что свидетельствует о благоприятном прогнозе течения заболевания. Если концентрация HBsAg в начальном периоде болезни высока, то только через 60 дней наблюдения можно прогнозировать его исчезновение из циркуляции. Если HBsAg исчезает из циркуляции 9

10 ДИАГНОСТИКА ГЕПАТИТА В через 1,5 месяца, то это свидетельствует о выздоровлении после острого ГВ. Если HBsAg циркулирует в крови около 3-х месяцев, а затем исчезает, то это означает выздоровление после прогредиентного течения ГВ. Сохранение HBsAg в крови более 6 месяцев свидетельствует о хронизации патологического процесса. Быстрое исчезновение HBsAg в первые дни желтухи с появлением анти- HBs и анти-hbe служит неблагоприятным прогностическим признаком и нередко предшествует фульминантному гепатиту. При этом имеет место гипериммунный или гиперреактивный вариант фульминантного ГВ. Длительное пожизненное выявление HBsAg в крови людей, без каких-либо клинических проявлений инфекции, означает «носительство» HBsAg. Чаще всего это состояние возникает при клинически латентной интегративной форме хронического ГВ. Обычно это хроническое носительство не отдельного HBsAg, а полного вириона. В этом случае в крови носителей HBsAg можно обнаружить антитела к HBcorAg класса IgG, а при высокой концентрации HBsAg в крови носителей могут обнаруживаться HBeAg и ДНК, что характеризует активную вирусную репликацию. Встречаются и HBeAg-негативные носители HBsAg, которые менее инфекционно опасны. Однако среди них могут оказаться лица с мутантным е- минус штаммом ВГВ. В крови этих носителей методом ПЦР может обнаруживаться вирусная ДНК. Формирование хронического носительства HBsAg обусловлено снижением иммунологической реактивности у этой группы больных. В ряде случаев ДНК вируса встраивается в ДНК гепатоцита не полностью, а частично, только тем участком, который кодирует синтез HBsAg. В этих случаях HBsAg синтезируется без других компонентов вириона. Такая ситуация возникает при здоровом носительстве HBsAg. Изучение распространенности HBsAg среди населения показало наличие бессимптомных носителей HBsAg, помогло установить их роль как основного резервуара инфекции, способствовало уточнению групп риска. В службе переливания крови отстранение от донорства лиц с наличием HBsAg привело к существенному снижению посттрансфузионных вирусных гепатитов. Методы выявления HBsAg условно разделяются на три поколения: 1) реакция преципитации в геле; 2) реакция встречного иммуноэлектрофореза; реакция связывания комплемента; реакция латекс-агглютинации; метод флюоресцирующих антител; иммуно-электронная микроскопия; 3) реакция обратной пассивной гемагглютинации; радиоиммунный, иммуноферментный анализы. Широкое применение в здравоохранении и в научных исследованиях нашли методы третьего поколения. Центральное место при этом занимают диагностические системы для иммуноферментного анализа из-за их высокой чувствительности (от 0,05 до 0,1 нг/мл), экспрессности, возможности проведения массовых обследований. Высокая специфичность этих систем обеспечивается обязательным проведением подтверждающего теста. Сердцевинный антиген (НВсоrАg) вы- 10

11 ИНФОРМАЦИОННЫЕ МАТЕРИАЛЫ является в ядрах пораженных гепатоцитов гистохимическими методами при биопсии печени. В сыворотке и плазме крови НВсоrАg в свободном виде не определяется, однако, являясь сильным иммуногеном, вызывает образование антител (анти-нвсоr). Антитела класса IgМ против НВсоrАg (анти-нвсоr-igм) являются маркером активной вирусной репликации и показателем острой фазы ГВ. Они появляются через 1 2 недели после обнаружения HBsAg, достигают максимальных значений на высоте желтушного периода через 2-3 месяца с момента обнаружения HBsAg, а затем их уровень снижается (Михайлов, 1990). При хроническом ГВ с активной вирусной репликацией анти-нвсоr-igм, как правило, определяются у всех больных. Для хронического ГВ без активной репликации характерно транзиторное появление анти-нвсоr-igм, а их исчезновение указывает на благоприятный прогноз. Особенно информативным бывает определение анти-нвсоr-igм в случае возникновения микстгепатита. Обнаружение HBsAg в этих случаях, казалось бы, подтверждает ГВ, но отрицательные результаты на анти-нвсоr-igм позволяют однозначно интерпретировать такие случаи, как наслоение другого вирусного гепатита на хроническое носительство ВГВ. И, наоборот, выявление анти-нвсоr-igм, независимо от наличия HBsAg указывает на активно текущий ГВ. У части больных (4-20%) при невозможности обнаружения поверхностного антигена анти-hbc-igm является единственным серологическим маркером инфицирования HBV (Бюргер, Новицкий, 1988). Антитела класса IgG против НВсоrАg (aнти-нвсоr-igg) появляются в сыворотке после обнаружения анти-нвсоr- IgМ или почти одновременно с ними. Однако титры IgМ и IgG анти-нвсоr существенно различаются. Анти-НВсоr- IgG достигают максимальных титров через 5 6 месяцев после появления HBsAg и пожизненно циркулируют в крови, нередко в довольно высоких титрах. Выявление анти-нвсоr является важным критерием диагностики ГВ, особенно при прекращении индикации HBsAg. В фазу так называемого «окна», после исчезновения HBsAg и до появления анти-нвs, анти-нвсоr становятся единственными серологическими маркерами ВГВ. Е-антиген ВГВ (НВеАg) ассоциируется с высокой инфекционностью крови, свидетельствуя об активной репликации ВГВ (Mark, 2000). Установлено, что высокие титры НВеАg соответствуют высокой ДНК-полимеразной активности, всегда сочетаются с обнаружением полных частиц Дейна. При попадании сыворотки, содержащей HBeAg, в кровь здорового человека опасность заражения во много раз выше, чем при контаминации кровью уже после наступления сероконверсии. При остром ГВ НВеАg обнаруживается в крови на ранних этапах инфекционного процесса уже при первых клинических проявлениях болезни, отставая на неделю от HBsAg. При циклическом течении острого ГВ, особенно при легкой форме болезни, его циркуляция транзиторна. HBeAg, как правило, перестает обнаруживаться в крови при еще продолжающейся НВs-антигенемии (Соринсон, 1997). 11

12 ДИАГНОСТИКА ГЕПАТИТА В Обнаружение HBeAg в крови пациентов после 2-х месяцев заболевания обозначает хронизацию патологического процесса (Жданов с соавт., 1986). Хронический ГВ с высокой репликативной активностью (репликативный ГВ) характеризуется циркуляцией свободного HBsAg в крови в течение длительного времени после инфицирования (6 месяцев — несколько лет). Хронический ГВ с низкой репликативной активностью (интегративный ГВ) характеризуется тем, что спустя 6 месяцев от начала заболевания в результате сероконверсии в крови пациентов появляются антитела к НВеАg, а сам он перестает обнаруживаться. Были идентифицированы вирусы, у которых в пре-ядерном регионе обнаруживался стоп-кодон, вследствие чего блокировался синтез HBeAg (Jinghsiung ou, 1997; Carman, 1989; Shunichi Sato, 1995). У больных, инфицированных этим мутантом определялись HBsAg, анти-нве, ВГВ-ДНК, но не обнаруживался HBeAg. Такие больные имеют обычно гистологическую картину, быстро прогрессирующую в направлении цирроза. Антитела к HBeAg (анти-нве) при остром ГВ циклического течения обнаруживаются в крови в сравнительно ранние сроки. Уже при первичном обследовании у значительной части больных свободный HBeAg не обнаруживается. Вскоре, с небольшим разрывом, появляются анти-нве. Обычно это происходит на 2 3 неделе желтушного периода, что позволяет прогнозировать благоприятный исход заболевания. Циркулируют анти-нве в крови чаще на протяжении 2-5 лет, реже несколько месяцев. Наступление сероконверсии HBeAg-анти-НВе знаменует резкое снижение активности инфекционного процесса (Ющук, Климова, 2000). Благоприятному прогнозу с потенциальной вероятностью выздоровления в отдаленном будущем соответствует быстрое нарастание содержания анти-нве. И, наоборот, монотонные показатели титров анти- НВе без тенденции к их нарастанию, преимущественно регистрируются у хронических латентных носителей HBsAg или при малосимптомных формах хронического ГВ. В случае хронического ГВ с высокой репликативной активностью анти-нве могут образовываться спустя много лет после появления антител к НВсоrАg или вовсе не появляться. Антитела к поверхностному антигену (анти-нвs) вырабатываются в ответ на HBsAg в период реконвалесценции спустя 3 4 недели, а иногда через 6 недель после исчезновения HBsAg. Сроки появления анти-нвз зависят от особенностей иммунологического статуса больного, активности его ответной реакции. Антитела к HBsAg свидетельствуют о ранее перенесенной инфекции или о наличии поствакцинальных антител (по данным ВОЗ, защитный уровень анти- HBsAg против ВГВ 10 мме/мл). Анти-НВs достигают максимальной концентрации через 1 2 года, с последующим постепенным снижением уровня вплоть до не обнаруживаемых концентраций. Титр анти-нвs редко бывает высоким. У 10 15% реконвалесцентов после острого ГВ, даже спустя годы после исчезновения HBsAg, анти-нвs не обнаруживаются. С другой 12

13 ИНФОРМАЦИОННЫЕ МАТЕРИАЛЫ стороны, анти-нвs могут сохраняться пожизненно. При хроническом течении ГВ у части больных анти-нвs обнаруживаются при продолжающейся НВsантигенемии. Обнаружение анти-нвs на фоне клинического улучшения у больных ГВ, особенно в сочетании с анти-нве, рассматривают как надежный критерий развития постинфекционного протективного иммунитета, выздоровления после острого ГВ. Накопление анти-нвs в крови является наиболее информативным тест-контролем, подтверждающим эффективность вакцинации против ВГВинфекции. Обнаружение анти-нвs в острую фазу ГВ рассматривается как прогностически неблагоприятный признак, Предлагаем вашему вниманию следующие препараты производства ООО «НПО «Диагностические системы»: ДС-ИФА-HBsAg ДС-ИФА-HBsAg-0,01 ИФА-HBsAg — подтверждающий тест ДС-ЭРИТРО-HBsAg ДС-ИФА-АНТИ-HBs ДС-ЭРИТРО-АНТИ-HBs ДС-ИФА-АНТИ-HBc ИФА-АНТИ-HBc-М-СКРИН ДС-ИФА-АНТИ-HBe ДС-ИФА-HBeAg OCO HBsAg П Контрольная панель сывороток, содержащих и не содержащих HBsAg Контрольная панель мутантных вариантов HBsAg субтипов ayw1 и adw2 ВЛК-HBsAg 13

14 ДИАГНОСТИКА ГЕПАТИТА В предвещающий угрозу фульминантного течения ГВ с гипериммунной комой (Соринсон, 1997). «ДС-ИФА-НВsАg» Тест-система «ДС-ИФА-НВsАg» была разработана в ООО «НПО «Диагностические системы» в 1997 году. Высокое качество диагностикума было подтверждено на сравнительных испытаниях диагностических иммуноферментных тест-систем, которые проводились МЗ РФ совместно с ГИСК им. Л.А.Тарасевича 1 апреля 1998 г., 28 марта 2000 г., 1 апреля 2002 г. «ДС-ИФА-НВsАg» была единственной отечественной тест-системой, которая по чувствительности (0,1 нг/мл) и специфичности не уступала зарубежным аналогам фирм: «Roche» (Швейцария), «Оrganon Teknika» (Нидерланды), «Sanofi Diagnostics Paster» (Франция), «Behring» (Германия). В 1998 году согласно приказу МЗ РФ от г. 282, в 2000 году согласно приказу МЗ РФ от г. 384, в 2002 году согласно приказу МЗ РФ от она была рекомендована для обследования доноров крови, органов и тканей человека, больных острыми и хроническими гепатитами и скрининга населения. Схема проведения иммуноферментного анализа представлена на рисунке 4. Тест-система позволяет выявлять HBsAg в сыворотке (плазме) крови человека в концентрации от 0,1 до 0,05 нг/мл. Указанная чувствительность была подтверждена при исследовании панелей сывороток и стандартов, содержащих HBsAg (табл. 1, табл. 2). В отделе по проблемам вирусных гепатитов Центра по контролю заболеваемости (г. Атланта, США), в феврале 2004 г. проведено исследование чувствительности тест-системы «ДС- ИФА-HBsAg» с использованием панели Boston Biomedica, Inc. (Табл. 3, табл. 4). Чувствительность тест-системы «ДС- ИФА-HBsAg» аттестована по отраслевому стандартному образцу HBsAg ВГВ «ОСО-HBsAg», разработанному в ООО «НПО «Диагностические системы» совместно с ГИСК им. Л.А.Тарасевича. «ОСО-HBsAg» аттестован по международным стандартам и рекомендован ГИСК им. Л.А.Тарасевича для определения чувствительности иммуноферментных тест-систем и концентрации HBsAg в сыворотке или плазме крови. Международный стандарт «International Standard for hepatitis B Surface antigen» (subtype ad) (NIBSC соdе 80/549) и второй HBsAg британский рабочий стандарт (Second British working standard for HBsAg — 0,5 UI/ml — NIBSC code: 99/ WI) были получены из Лондонского Рисунок 4 Схема проведения иммуноферментного анализа 14

15 ИНФОРМАЦИОННЫЕ МАТЕРИАЛЫ Таблица 1 Результаты выявления HBsAg на сравнительных испытаниях 2002 г. (BBI Panel MHA 402) Концентрация HBsAg нг/мл ООО «НПО «Диагностические системы», «ДС-ИФА-НBsАg» «BIO-RAD», «Monolisa-AgHBs Plus» ЗАО «Ниармедик-плюс», «Мигех HBsAg Версия 3» 1 отр. 0,7 0,6 0,56 2 отр. 0,5 0,6 0,56 3 отр. 0,5 0,5 0,56 4 отр. 0,5 0,4 0,58 5 1,0 ad 6,6 4,4 3,2 6 0,6 ad 4,6 3,5 3,9 7 0,2 ad 2,0 1,2 1,2 8 0,9 ay 7,0 3,7 4,5 9 0,8 ay 6,7 4,6 4,2 10 0,6 ay 5,6 3,6 2,7 11 0,4 ay 3,5 2,5 2,5 12 0,2 ay 1,7 1,0 1,3 13 0,1 ay 1,5 0,9 1,9 14 Поз ,3 4,6 17,1 15 Поз ,5 4,4 15,8 16 Поз. 1-1,5 11,7 7,8 8,0 17 Поз. 0,5-0,7 5,0 2,5 2,9 18 Поз. 0,5-0,7 5,0 2,8 5,6 19 Поз. 0,1-0,25 1,5 1,3 1,9 20 Поз. 0,1-0,25 1,2 0,9 1,5 Таблица 2 Результаты выявления HBsAg на сравнительных испытаниях 2002 г. при использовании отраслевого образца ОСО Концентрация HBsAg нг/мл ООО «НПО «Диагностические системы», «ДС-ИФА-НBsАg» «BIO-RAD», «Monolisa-AgHBs Plus» ЗАО «Ниармедик-плюс», «Мигех HBsAg Версия 3» 1 2,0 25,8 11,1 16,8 2 1,0 14,4 6,3 9,6 3 0,5 9,2 3,6 5,3 4 0,25 4,8 1,8 2,7 5 0,1 2,4 1,2 1,6 6 0,05 1,2 0,7 0,9 15

16 ДИАГНОСТИКА ГЕПАТИТА В Таблица 3 Оценка чувствительности тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg» (панель Boston Biomedica, Inc Hepatitis B Surface Antigen Sensitivity Panel 1 (PHA 807) Субтип Конц., МЕ/мл ООО «НПО «Диагностические системы», «ДС-ИФА-HBsAg» Таблица 4 Оценка чувствительности тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg» (панель Boston Biomedica, Inc Нераtitis В seroconversion Panel (PHM 933), Subtype ad) «Аbbott», «Аuszyme Monoclonal» РИА Ad РИА Ad РИА Ad РНА Ad РИА Ad РНА Ad РНА Ad 0,12 1,6 1,7 РНА Ad ,4 1.1 РНА Ad РНА Ad РНА Ау РНА Ау РНА Ау РНА Ау РНА Ау РНА Ау РНА Ау РНА Ау РНА Ау ОРНА Ау РНА Дни с первого забора крови ООО «НПО «Диагностические системы», «ДС-ИФА-HBsAg» «Аbbot», «Auszyme Monoclonal» «Ortho-Clinical Diagnostics», «Ortho Test System 3» РИМ ,8 0,2 0,5 РНМ ,2 0,3 0,2 РИМ ,4 1,4 1,2 РНМ ,8 2,9 3,3 РНМ ,7 15,2 16,7 РНМ ,3 оvеr >81,2 16

17 ИНФОРМАЦИОННЫЕ МАТЕРИАЛЫ Национального института биологических стандартов и контролей. 1 нг/мл эквивалентен 1 МЕ/мл. Как видно из таблицы 3, чувствительность тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg» составляет 0,05-0,07 нг/мл (МЕ/мл). В 2007 году начат выпуск тест-системы для определения HBsAg с чувствительностью 0,01 ME/мл — «ДС-ИФА- HBsAg-0,01». «ИФА-HBsAgподтверждающий тест» Одноэтапный тест для подтверждения специфичности результатов выявления HBsAg в сыворотке (плазме) крови человека. «ИФА-HBsAg-подтверждающий тест» содержит два компонента: нейтрализующий и контрольный реагенты. Тест основан на реакции между HBsAg, содержащемся в образце, и поликлональными антителами козы к HBsAg (нейтрализующий реагент), дополнительно введенными в инкубационную смесь. В качестве контроля используются иммуноглобулины козы, не содержащие анти-нвs (контрольный реагент). Цветные лиофилизированные контрольный и нейтрализующий реагенты позволяют избежать ошибок при постановке реакции. Наборы могут быть использованы для подтверждения специфичности результатов выявления HBsAg тест-системами других фирмпроизводителей. «ИФА-АНТИ-НВс-М-СКРИН» В 2003 году в ООО «НПО «Диагностические системы» разработана иммуноферментная тест-система «ИФА-АНТИ- НВс-М-СКРИН», предназначенная для выявления антител класса IgM к НВсоr антигену ВГВ в сыворотке крови человека. Присутствующие в образце специфические антитела связываются с рекомбинантным НВсоr антигеном (производства ООО «НПО «Диагностические системы»), сорбированным на твердой фазе, и с мышиными монокпональными антителами против IgМ человека, меченными пероксидазой хрена. Определение титра антител класса IgМ в сыворотках больных ГВ позволило установить, что чувствительность Таблица 5 Сравнительный анализ чувствительности тест-систем для выявления анти-нвсоr-igm сыворотки Максимальные разведения сывороток, дающие положительную реакцию на анти-нвcor-igм «ИФА-АНТИ-НВс-М-СКРИН» «Hepanostica НВc-IgМ» 1 1:1024 1: :512 1: :1024 1: :1024 1:

18 ДИАГНОСТИКА ГЕПАТИТА В разработанной тест-системы соответствует уровню чувствительности тестсистем ведущих мировых производителей (табл. 5). Наиболее опасными в плане передачи ВГВ трансфузионным путём являются доноры, негативные по HBsAg, но имеющие анти-нвсоr-igм. Поэтому дополнительное тестирование доноров на анти-нвсоr-igм может повысить качество скрининга донорской крови. С помощью тест-системы «ИФА-АН- ТИ-НВс-М-СКРИН» было проверено 1360 образцов донорских сывороток. Из них 4 сыворотки (0,3%) содержали анти-нвсоr-igм, анти-нвсоr-igg и были отрицательными на HBsAg, что может свидетельствовать о возможной инфекции. Данные, полученные при испытании панелей производства Boston Biomedica inc, подтверждают высокую чувствительность теста (табл. 6). Тест-система «ИФА-АНТИ-HBc-M- СКРИН» позволяет выявлять анти- HBcor-IgM в сыворотке (плазме) крови человека с высокой чувствительностью и специфичностью, удобна в применении и может быть использована для массового скрининга населения. «ДС-ИФА-АНТИ-HBc» Предназначена для выявления суммарных антител к HBcor антигену в сыворотке (плазме) крови человека. Тест-система построена по типу конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа. В лунках планшета иммобилизован HBcorAg (производства ООО «НПО «Диагностические системы»). Антитела к HBcorAg в анализируемой пробе конкурируют за связывание с меченными пероксидазой антителами. Чем больше в исследуемом образце антител, тем меньше меченных ферментом антител свяжется с иммуносорбентом. Интенсивность окраски будет снижена. Образец сыворотки крови в объеме 50 мкл анализируется не разведенным. Процедура исследования проводится в одну стадию. Общая продолжительность инкубаций 2 ч 30 мин. Тест-система имеет высокую чувствительность и специфичность, что подтверждается в сравнительных испытаниях с тестами ведущих мировых производителей. Исследование 36 образцов сывороток крови с помощью тест-систем: «ДС-ИФА-АНТИ-HBc» и «Heponostica анти-hbc» («Organon Teknica», Нидерланды) показало полное совпадение результатов (табл. 7). «ДС-ИФА-HBeAg» Тест-система разработана в 2002 году. Предназначена для выявления е- антигена вируса гепатита В в сыворотке (плазме) крови людей методом иммуноферментного анализа и может быть использована для специфической диагностики, определения активности инфекционного процесса, прогнозирования тяжести и исхода гепатита В. Была проведена апробация тест-системы «ДС-ИФА-HBeAg» в сравнении с аналогичным тестом «Monolisa НВе» («BIO-RAD», Франция) с использованием 49 образцов сывороток крови, положительных на HBsAg, анти-нвс IgМ, анти-нвc-igg (табл. 8). Результаты определения HBeAg, полученные с помощью двух тест-систем, полностью совпадают. 18

19 ИНФОРМАЦИОННЫЕ МАТЕРИАЛЫ Таблица 6 Сравнительная оценка чувствительности тест-систем «ИФА-анти-НВс-М-скрин» (ООО «НПО «Диагностические системы», Россия) и «Согсуmе-М» («Abbott», США) Название панели РНЕ 102 (ВВI)* РНС 201 (ВВI)** РНЕ 202 (ВВI)*** Сывороток Тестсистема «ИФА-АНТИ- НВсМ-СКРИН» «CorzymeM» «ИФА-АНТИ- НВсМ-СКРИН» ОПобр./ОПф. «Соггуте-М» «ИФА-АНТИ- НВсМ-СКРИН» «Соrzуmе-М» * «Anti-НВсоr-IgM Low Titer Perfomance Panel» (РНЕ 102) ** «Anti-НВs Mixed Titer Perfomance Panel» (РНС 201) *** «Anti-НВсоr-IgM Mixed Titer Perfomance Panel» (РНЕ 202) сыворотки 19

20 ДИАГНОСТИКА ГЕПАТИТА В Таблица 7 Сравнительная оценка чувствительности и специфичности тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-НВс» и «Hepanostica анти-нвс» («Organon Teknica») сыворотки ООО «НПО «ДС» «ИФА-анти-НВс» ОПобр/ОПкр «Organon Teknica», «Hepenostica анти-нвс» ОПобр/ОПкр сыворотки ООО «НПО «ДС» «ИФА-анти-НВс» ОПобр/ОПкр «Organon Teknica», «Hepanostica анти-нвс» ОПобр/ОПкр 1 3,337-2, , , ,989-3, ,685-7, ,084-2, , , , , ,123-3, , , ,411-3, , , ,861-2, , , , , ,485-3, ,204-1, ,311-3, ,520-4, , , ,114-3, ,030-1, ,861-4, ,388-5, , , , , , , , , ,028-3, ,028-1, ,988-3, ,851-3, , , ,879-3, , , ,033-3, , ,495 + Таблица 8 Сравнительная оценка чувствительности тест-систем «ДС-ИФА-HBeAg» и «Monolisa НВе» («BIO-RAD», Франция) Показатель ООО «НПО «ДС», «ДС-ИФА-HBeAg» «BIO-RAD», «Monolisa НВе» Количество исследованных сывороток Выявлено положительных сывороток Выявлено отрицательных сывороток

21 ИНФОРМАЦИОННЫЕ МАТЕРИАЛЫ «ДС-ИФА-АНТИ-НВе» Тест-система «ДС-ИФА-АНТИ-НВе» разработана в 2003 году. Тест-система «ДС-ИФА-АНТИ-НВе» предназначена для выявления антител класса IgG к е- антигену ВГВ в сыворотке (плазме) крови человека и может быть использована при прогнозе течения инфекционного процесса и контроле проводимой терапии при ГВ. Повышение специфичности тестсистемы было достигнуто за счет использования рекомбинантного HBeAg (АНВV 102, производство ООО «НПО «Диагностические системы»), сорбированного на твёрдой фазе, конъюгата анти-igg с пероксидазой хрена и изменения схемы проведения анализа. Исследование 32-х образцов сывороток с помощью тест-систем» ДС-ИФА- АНТИ-НВе» и «Monolisa НВе» («BIO- RAD», Франция) показало полное совпадение результатов (табл.9). Таблица 9 Сравнительная оценка чувствительности и специфичности тест-систем «ДС-ИФА-АНТИ-НВе» и «Monolisa НВе» («BIO-RAD», Франция) «ДС-ИФА-АНТИ- НВе» ОП обр/опкр «Monolisa НВе» ОП обр/опкр «ДС-ИФА-АНТИ- НВе» ОПобр/ОПкр «Monolisa НВе» ОПобр/ОПкр 1 0,705-1, ,486-1, , , , ,750-2, ,764-2, , , ,600-2, , , ,259-1, , , ,073-2, ,109-2, , , ,264-0, ,027-1, , , ,177-1, , , , , , , , , , , ,136-1, , , ,686-2, ,832-1, ,127-2, ,114-2, ,314-1, , , , ,

22 ДИАГНОСТИКА ГЕПАТИТА В «ДС-ИФА-АНТИ-НВs» Выявляет антитела к поверхностному антигену ВГВ с целью специфической диагностики инфекции, определения тяжести течения и прогноза заболевания, для изучения иммунного статуса населения в предвакцинальный период и оценки эффективности вакцинации, а так же при выборе плазмы с высоким содержанием анти-нвs для приготовления специфических иммуноглобулинов. Препарат может быть использован для оценки иммуногенности вакцин против ГВ на животных. При конструировании диагностикума использована сгрептавидин-биотиновая система. Достоинством разработанного препарата является высокая чувствительность регистрации образуемого иммунологического комплекса — 5 мме/мл (защитный уровень анти- HBsAg — 10 мме/мл). Клинические испытания тест-систем «ДС-ИФА-АНТИ-НВs» и «Monolisa Anti НВs 3,0» («BIO-RAD», Франция), проведенные на образцах сывороток реконвалесцентов после перенесённого ГВ и вакцинированных лиц, показали, что результаты выявления антител к HBsAg, полученные с помощью двух препаратов полностью совпадают (табл. 10,11). Таблица 10 Оценка чувствительности и специфичности тест-систем «ДС-ИФА-АНТИ-НВs» и «Monolisa Anti НВs 3,0» («BIO-RAD», Франция) сывороток ООО «НПО «Диагностические системы», «ИФА-АНТИ-НВs» ОПобр/ОПкрит «BIO-RAD», «Monolisa Anti НВs 3,0» ОПобр/ОПкрит 1 3,050 2, ,437 25, ,109 14, ,303 24, ,176 1, ,908 2, ,966 16, ,395 2, ,857 3, ,504 0, ,638 0, ,723 0,3 13 0,538 0, ,824 0, ,529 0,3 22

23 ИНФОРМАЦИОННЫЕ МАТЕРИАЛЫ Таблица 11 Оценка чувствительности тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-НВs» с помощью «Monolisa anti-нвs Standards» и «ОСО » Концентрация мме/мл «BIO-RAD», «Monolisa anti-нвs Standards» Стандарт Anti НВs, ОП/ОПкрит НПО «Биомед», «ОСО » ,0 14, ,5 10,8 50 8,0 7,9 10 2,8 2,6 5 1,2 1,18 2,5 0,9 0,85 Литература 1. Балаян М.С. Вирусные гепатиты / М.С. Балаян, М.И Михайлов // Энциклопедический словарь. — М.: Амипресс, С Бюргер А. Вирусные гепатиты / А. Бюргер, И Новицкий. — Рига: Звайгзне, с. 3. Жданов В.М. Вирусные гепатиты / В.М. Жданов, ВА Ананьев, В.М. Стаханова. — М.: с. 4. Козловская Т. М. Структура и экспрессия гена поверхностного антигена вируса гепатита В человека / Т.М. Козловская, П.П. Пумпен // Молекулярная биология Т С Майер К.П. Гепатит и последствия гепатита: Пер. с нем. / К.П. Майер; Ред А.А. Шептулина. — М.: ГЕОТАР Медицина, с. 6. Михайлов М.И. Гепатит В — аспекты изучения / М.И. Михайлов // Вопросы вирусологии С Михайлов М.И. Гепатит В и гепаднавирусы: Автореф. дис… д-ра мед. наук. — М., Онищенко ГГ. Распространение вирусных гепатитов как угроза национальной безопасности / Г.Г. Онищенко, Л А Дементьева // Журн. микробиол С Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты / С.Н. Соринсон. — Санкт-Петербург: Теза, С Холмс К. Вирусология: Пер. с англ. / К. Холмс, Д. Ливингстон, И. Бикел. — М.: Мир, с. 11. Шамшева О.В. Профилактика гепатита В у детей с хроническими заболеваниями с помощью вакцины «Эувакс В» / О.В. Шамшаева, О.В. Кладова, С.Н. Кузин // Вакцинация Т.18, 6. — С Ющук Н.Д. Острые вирусные гепатиты / Н.Д. Ющук, ЕА Климова // Русский медицинский журнал Т.8, 17, — С Baumeister MA. Hepatitis В Virus e Antigen Specific Epitopes and Limitations of Commercial Anti-Hbe Immunoassays / Mark A. Baumeister // Journal of Medical Virology N P Carman W.F Mutations preventing formations of hepatitis В е antigen in patients with chronic hepatitis В infection / W.F. Carman, M.R. Jacyna, S. Hadriyannis et al. // Lancet N 2. — P Chairez R. Comparative Biophisical Studies of hepatitis В antigen, subtypes adw and ayw/ RChairez, F.B. Hoilinger//J. Viroi N P Courouce A.M. HBsAg antigen subtypes: proceedings of the international workshop on HBs antigen subtypes / A.M. Courouce, P.V. Holland, J.V. Muller, J.P. Soulier // Haematologica N P Courouse-Panty A.M. Antigen and anti two categories of chronic carriers of hepatitis В surface antigen / A.M. Courouse-Panty, A Plancon // Vox. Sang N34.-P Courouse-Panty A.M. Further data on HBs antigen subtypes — geographical distribution // A.M. Courouse-Panty // Vox Sang N P Elghouzzi M.H. Transmission of hepatitis В virus by HBV — negative blood transfusion / M.H. Elghouzzi, A.M. Courouce, L.O. Magnius et al. // Lancet Vol. 346, N P Ganem D The molecular biology of the hepatitis В viruses / D Ganem, H.E. Varmus // Annu Rev Biohem N P Jing-hsiung Molecular biology of hepatitis В virus e antigen. / Jing-hsiung // Journal of Gastroenterology and Hepatology N P Lok A.S.F Prevalence of isolated antibody to hepatitis В in an area endemic for hepatitis В / A.S.F. Lok, C.L. Lai, P.C. Wu // Hepatoiogy N 8. — P Shunichi Sato. Hepatitis’ В Virus Strains with Mutations in the Core Promoter in Patients with Fulminant Hepatitis / Shunichi Sato, Kazuyuki Suzuki // Annals of Internal Medicine , — N P Tiollais P. The hepatitis В virus / P. Tiollais, C. Pourcel, A. Dejean // Nature N317.-P Zuckerman A.J. Effect of hepatitis В virus mutants on efficacy of vaccination / A.J. Zuckerman // Lancet N P

24 ДИАГНОСТИКА ГЕПАТИТА В В 2007 году начат выпуск новых препаратов: Контрольная панель мутантных вариантов HBsAg субтипов ayw1 и adw2 Предназначена для оценки способности иммуноферментных тест-систем выявлять мутантные варианты HBsAg. Мутантные варианты HBsAg содержат известные точечные мутации в а детерминанте субтипов ayw1 и adw2. Каждый мутантный вариант HBsAg в панели представлен в двух разведениях. Комплект состоит из 26 лиофильно высушенных образцов. Срок годности 12 месяцев. ВЛК-HBsAg образец для внутрилабораторного контроля качества исследований на HBsAg Предназначен для обеспечения внутрилабораторного контроля качества исследований при постановке иммуноферментного анализа на определение HBsAg в сыворотке крови, оценки сходимости и воспроизводимости результатов измерений HBsAg в ежедневной практике лабораторий и выявления систематических и случайных ошибок при постановке ИФА. Комплект включает 24 флакона с лиофильно высушенным образцом сыворотки; инструкцию по применению. Срок годности 24 месяца. 24



Источник: docplayer.ru


Добавить комментарий